色譜方法開發(fā)時，一般選擇常用的試劑、pH條件、緩沖鹽、以及常用色譜柱的組合作為起始條件，然后對流動相比例進行一系列調整，直至獲得比較滿意的峰形和分離效果，如何正確科學地選擇液相流動相呢？

原則1：由強到弱

 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然后根據(jù)出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

原則2：三倍規(guī)則

 每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。

原則3：粗調轉微調

當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。

甲酸：通常使用的濃度在0.5%以下，能夠讓水的pH達到二點幾的級別。

乙酸：酸性比甲酸略弱，通常使用濃度不超過0.5%，能夠使水的pH到達到二點幾的級別。

三氟乙酸：比較強的酸，使用濃度通常不超過0.5%，能使水的pH達到2以下，具有很大的離子強度及一定的離子對作用，是分析蛋白/多肽時常用的添加劑。

磷酸：這是一種不揮發(fā)性的酸，離子強度也不錯，最重要的是，它在低波長紫外區(qū)無本底吸收。

堿類添加劑常見的是氨水和三乙胺，兩者都能讓水的pH到達非常高的水平，高到能把硅膠顆粒溶解掉。

甲酸鹽：通常在液相色譜中常用的甲酸鹽都是甲酸銨，而甲酸鹽與甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸銨緩沖體系，大概緩沖能力在pH3～4.5的范圍之內，只要調節(jié)兩者濃度的比例即可。

乙酸鹽：常見為乙酸銨，在使用上，和甲酸鹽十分類似，離子強度也不高。與乙酸配合的乙酸-乙酸銨緩沖體系pH的控制能力在pH4～5.5左右。

磷酸鹽 ：常用的是磷酸的鈉鹽和鉀鹽，二者對pH的控制能力十分接近，只是離子強度稍有差異，絕大多數(shù)情況下是可以互換使用的，磷酸由于是多元酸，能夠形成一氫鹽和二氫鹽，所以使用磷酸緩沖體系調節(jié)pH也是組合比較多，跨度比較大的，并且可以提供較高的離子強度。

磷酸-磷酸二氫鈉：pH1.2～3.1左右的范圍；

磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉：pH6.5～8左右的范圍。

最后，比起單純的酸堿，鹽類，特別是具有緩沖能力的鹽類可以很好的控制流動相的pH值，根據(jù)不同緩沖鹽中兩種鹽的配比，可以很容易的配置出一定pH的緩沖溶液。上述的緩沖對能調節(jié)的pH范圍指的都是在保持緩沖能力的范圍之內，如果僅僅是調節(jié)pH的話，范圍還可以再擴展一些。

此外，當分析物含有可電離官能團時，（在不同pH條件下可處于不同程度的電離狀態(tài)，如伯、仲、叔氨基、羧酸基），pH條件將強烈影響分析物的反相保留狀態(tài)，也會造成最強烈的選擇性改變效果。

對于可電離的化合物，要獲得最強的反相保留，分析物應盡可能的不帶電或電離，此時分析物極性相對較小，在反相色譜柱上的保留就更強，中性化合物無任何可電離基團，不受pH影響。

酸性和堿性化合物在其未電離狀態(tài)下時反向保留最大，中性化合物的保留不受pH影響。

在選擇流動相時，應避免在化合物分子的pKa值附近篩選pH條件，否則，pH值的微小變化都會導致保留和選擇性的劇烈變化。保留曲線的平臺區(qū)是分析方法耐用性較強的區(qū)域。流動相中有鹽時，應確保鹽不會析出。

采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。